TABLEAU 1

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Vous pouvez consulter le tableau dans le JO no 0146 du 25/06/94 Page 9191 a 9199
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Ajoutez 1,0 ml de la suspension à 5 p. 100 d'érythrocytes de mouton à chaque tube de la série de dilutions d'hémolysine à partir de la dilution 1: 75 et mélangez. Faites incuber à 37 oC pendant 30 minutes.
Transférez 0,2 ml de chaque mélange de dilution d'hémolysine à de nouveaux tubes et ajoutez 1,10 ml de solution tampon gélatine-barbital et 0,2 ml d'une dilution de complément de cobaye (par exemple 1: 150). Effectuez ces opérations en double.
Préparez 3 tubes témoins de cellules sans hémolyse avec 1,4 ml de solution tampon gélatine-barbital et 0,1 ml de la suspension d'érythrocytes de mouton à 5 p. 100.
Préparez 3 tubes témoins de cellules à hémolyse totale avec 1,4 ml d'eau et 0,1 ml de la suspension d'érythrocytes de mouton à 5 p. 100.
Faites incuber tous les tubes à 37 oC pendant 60 minutes et centrifugez à 1 000 g pendant 5 minutes.
Mesurez l'absorbance (V.6.19) de chaque liquide surnageant à 541 nm et calculez le degré d'hémolyse de chaque tube à l'aide de l'expression:

Aa - A1 x 100

Aa - A1

x 100

Ab - A1

Aa = absorbance des tubes contenant les dilutions d'hémolysine.
Ab = la moyenne de l'absorbance des trois tubes avec hémolyse totale.
Al = la moyenne de l'absorbance des trois tubes sans hémolyse.
Construisez une courbe sur papier graphique linéaire en portant le degré d'hémolyse (p. 100) en ordonnée et l'inverse de la dilution d'hémolysine en abscisse. La dilution optimale de l'hémolysine est déterminée à partir du graphique, en choisissant une dilution telle qu'une augmentation de la quantité d'hémolysine ne produit pas de variation sensible du degré d'hémolyse. Cette dilution est considérée comme contenant 1 unité d'hémolyse minimale (1 UHM) dans 1,0 ml. Pour la préparation des érythrocytes de mouton sensibilisés, la dilution d'hémolysine à hémolyse optimale contient 2 UHM par millilitre.
Le titrage de l'hémolysine n'est valable que si l'hémolyse maximale se situe entre 50 p. 100 et 70 p. 100. Sinon, répétez le titrage en utilisant une solution de complément plus ou moins diluée.
Préparation des érythrocytes de mouton sensibilisés de façon optimale (système hémolytique).
Préparez une quantité appropriée d'hémolysine diluée contenant 2 UHM/ml.
Préparez un volume égal de suspension standardisée d'érythrocytes de mouton à 5 p. 100. Ajoutez la dilution d'hémolysine à la suspension standardisée de cellules et mélangez. Faites incuber à 37 oC pendant 15 minutes; conservez au réfrigérateur à 2-8 oC et utilisez dans les 6 heures.
Titrage du complément.
Préparez une dilution appropriée de complément (par exemple 1: 250) avec la solution tampon gélatine-barbital et effectuez le titrage en double selon le tableau 2.
Ajoutez 0,2 ml d'érythrocytes de mouton sensibilisés à chaque tube, mélangez et faites incuber à 37 oC pendant 60 minutes. Refroidissez les tubes dans un bain de glace et centrifugez à 1 000 g pendant 5 minutes. Mesurez l'absorbance du surnageant à 541 nm et calculez le degré d'hémolyse (Y) à l'aide de l'expression:

Ac - A1

Ab - A1

Ac = absorbances des tubes 1 à 12.
Ab = moyenne de l'absorbance des tubes à 100 p. 100 d'hémolyse.
Al = moyenne de l'absorbance des tubes à 0 p. 100 d'hémolyse.