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Arrêté du 3 juin 1994

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JORF n°146 du 25 juin 1994

V.2.2.10. Essai de la fonction Fc

de l'immunoglobuline

Sang humain stabilisé. Recueillez du sang humain de groupe O sur une solution anticoagulante ACD. Conservez le sang stabilisé à 4 oC pendant 3 semaines au maximum.
Solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2. Dissolvez 1,022 g de phosphate disodique anhydre, 0,336 g de phosphate monosodique anhydre et 8,766 g de chlorure de sodium R dans 800 ml d'eau et complétez à 1 000 ml avec le même solvant.
Solution mère de magnésium et de calcium. Dissolvez 1,103 g de chlorure de calcium R et 5,083 g de chlorure de magnésium R dans de l'eau et complétez à 25 ml avec le même solvant.
Solution mère de tampon barbital. Dissolvez 207,5 g de chlorure de sodium R et 25,48 g de barbital sodique R dans 4 000 ml d'eau et ajustez à pH 7,3 avec de l'acide chlorhydrique 1 N. Ajoutez 12,5 ml de solution mère de magnésium et de calcium et complétez à 5 000 ml avec de l'eau. Filtrez sur membrane (0,22 ,m) et conservez à 4 oC en récipient de verre.
Solution tampon albumine-barbital. Dissolvez 0,150 g d'albumine bovine R dans 20 ml de solution mère de tampon barbital et complétez à 100 ml avec de l'eau.
Solution d'acide tannique. Dissolvez 10 mg d'acide tannique R dans 100 ml de solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2. Préparez immédiatement avant l'emploi.
Complément de cobaye. Mélangez les sérums préparés à partir du sang de dix cobayes au moins. Séparez le sérum du sang coagulé par centrifugation à 4 oC environ. Conservez le sérum en petites quantités à une température inférieure à - 70 oC. Le sérum peut également être cryodesséché. Immédiatement avant de commencer l'hémolyse à l'aide du complément, diluez à 125-200 CH50 par millilitre avec la solution tampon albumine-barbital et maintenez la solution diluée dans un bain de glace pendant l'essai.
Antigène rubéoleux. Antigène approprié pour les titrages de l'inhibition d'hémagglutination. Titre > 256 unités HA.
Traitement des érythrocytes à l'acide tannique. Séparez les érythrocytes par centrifugation d'un volume approprié de sang humain stabilisé. Lavez les érythrocytes 3 fois au moins avec la solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2 puis mettez-les en suspension à 2 p. 100 V/V dans la solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2. Prélevez 0,1 ml de solution d'acide tannique et complétez à 7,5 ml avec la solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2 (concentration finale 1,3 x 10-4 p. 100 m/V); mélangez un volume de la dilution récemment préparée et un volume de la suspension d'érythrocytes et faites incuber à 37o C pendant dix minutes. Recueillez les cellules traitées à l'acide tannique par centrifugation (400-800 g pendant dix minutes),
rejetez le liquide surnageant et lavez les érythrocytes une fois avec la solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2. Remettez les érythrocytes en suspension à 1 p. 100 V/V dans la solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2.
Addition de l'antigène aux érythrocytes. Prélevez un volume approprié (Vs) d'érythrocytes traités à l'acide tannique, ajoutez 0,2 ml d'antigène rubéoleux par 1,0 ml d'érythrocytes et faites incuber à 37o C pendant trente minutes. Recueillez les cellules par centrifugation (400-800 g pendant dix minutes) et rejetez le surnageant, en laissant un volume de 200 ,l. Ajoutez un volume de solution tampon albumine-barbital égal au liquide surnageant rejeté, remettez les érythrocytes en suspension, recueillez-les comme il est décrit ci-dessus et répétez le lavage. Complétez les 200 ,l obtenus aux trois quarts de Vs; on obtient ainsi le volume initial (Vi). Mélangez 900 ,l de solution tampon albumine-barbital et 100 ,l de Vi, qui est ainsi réduit au volume résiduel Vr, et déterminez l'absorbance initiale à 541 nm (A). Diluez Vr par un facteur égal à A à l'aide de solution tampon albumine-barbital. On obtient ainsi le volume final ajusté Vf = Vr x A d'érythrocytes humains sensibilisés et une valeur pour A de 1,0 0,1 dans le cas d'une dilution au 1/10.
Liaison de l'anticorps sur les érythrocytes traités à l'acide tannique et couverts d'antigène. Préparez les solutions suivantes successivement et en double. Utilisez une cuve semi-micro (par exemple, des cuves à usage unique) ou un tube à essai pour chaque solution.

  1. Solutions à examiner. Prélevez des volumes de la préparation à examiner contenant 30 mg et 40 mg d'immunoglobuline respectivement et complétez à 900 ,l avec la solution tampon albumine-barbital.
  2. Solutions de référence. Préparez la solution comme il est décrit pour la solution à examiner à partir de l'immunoglobuline humaine PBR.
  3. Témoin complément. 900 ,l de solution tampon albumine-barbital. A chaque cuve/tube à essai, ajoutez 100 ,l d'érythrocytes humains sensibilisés et mélangez soigneusement.
    Laissez reposer pendant quinze minutes, ajoutez 1 000 ,l de solution tampon albumine-barbital, recueillez les érythrocytes par centrifugation (1 000 g pendant dix minutes) de la cuve/tube à essai et enlevez 1 900 ,l du liquide surnageant. Ajoutez 1 900 ,l de solution tampon albumine-barbital et répétez le lavage en laissant un volume final de 200 ,l. Les échantillons peuvent être conservés à 4 oC pendant 24 heures.
    Hémolyse provoquée par le complément. Pour la détermination de l'hémolyse,
    ajoutez 600 ,l de solution tampon albumine-barbital chauffée à 37 oC à l'échantillon à examiner, remettez les érythrocytes en suspension avec précaution en les pipettant plusieurs fois (cinq fois au moins) et placez la cuve dans le porte-échantillon d'un spectrophotomètre muni d'un thermostat.
    Après deux minutes, ajoutez 200 ,l de complément de cobaye dilué à 125-200 CH50/ml, mélangez soigneusement en pipettant le mélange 2 fois puis commencez immédiatement l'enregistrement de l'absorbance à 541 nm en fonction du temps, en utilisant la solution tampon albumine-barbital comme liquide de compensation. Arrêtez l'enregistrement si la courbe de l'absorbance en fonction du temps a nettement dépassé le point d'inflexion.
    Evaluation. Déterminez la pente (S) de la courbe d'hémolyse au point d'inflexion approximatif: délimitez sur la courbe dans la partie à plus forte pente des sections par intervalle de temps approprié (par exemple, t = 1 min.) et calculez S, exprimé en A par minute, entre les points d'intersections adjacents. Trouvez la valeur maximale de la pente (Sexp).
    Déterminez l'absorbance de départ (As) par extrapolation de la courbe, qui est presque linéaire et parallèle à l'axe du temps dans les premières minutes de l'enregistrement.
    Corrigez Sexp selon l'expression:

S' Sexp

Sexp

S' =

AS

Calculez la moyenne arithmétique des valeurs de S' pour chaque préparation. Calculez l'indice de la fonction Fc (IFc) à partir de l'expression:

I Fc 100 x (S' - S'c)

100 x (S' - S'c)

I Fc =

S's - S'c

S' = moyenne arithmétique de la pente corrigée pour la préparation à examiner.
S's = moyenne arithmétique de la pente corrigée pour la préparation de référence.
S'c = moyenne arithmétique de la pente corrigée pour le témoin complément. Calculez l'indice de la fonction Fc de la préparation à examiner. La valeur n'est pas inférieure à celle indiquée dans le feuillet qui accompagne la préparation de référence.

VII.1.1. REACTIFS

Phosphate disodique anhydre. Na2HPO4 (Mr 142,0).
Phosphate monosodique anhydre. NaH2PO4 (Mr 120,0).

1 version

Historique des versions

Version 1

V.2.2.10. Essai de la fonction Fc

de l'immunoglobuline

Sang humain stabilisé. Recueillez du sang humain de groupe O sur une solution anticoagulante ACD. Conservez le sang stabilisé à 4 oC pendant 3 semaines au maximum.

Solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2. Dissolvez 1,022 g de phosphate disodique anhydre, 0,336 g de phosphate monosodique anhydre et 8,766 g de chlorure de sodium R dans 800 ml d'eau et complétez à 1 000 ml avec le même solvant.

Solution mère de magnésium et de calcium. Dissolvez 1,103 g de chlorure de calcium R et 5,083 g de chlorure de magnésium R dans de l'eau et complétez à 25 ml avec le même solvant.

Solution mère de tampon barbital. Dissolvez 207,5 g de chlorure de sodium R et 25,48 g de barbital sodique R dans 4 000 ml d'eau et ajustez à pH 7,3 avec de l'acide chlorhydrique 1 N. Ajoutez 12,5 ml de solution mère de magnésium et de calcium et complétez à 5 000 ml avec de l'eau. Filtrez sur membrane (0,22 ,m) et conservez à 4 oC en récipient de verre.

Solution tampon albumine-barbital. Dissolvez 0,150 g d'albumine bovine R dans 20 ml de solution mère de tampon barbital et complétez à 100 ml avec de l'eau.

Solution d'acide tannique. Dissolvez 10 mg d'acide tannique R dans 100 ml de solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2. Préparez immédiatement avant l'emploi.

Complément de cobaye. Mélangez les sérums préparés à partir du sang de dix cobayes au moins. Séparez le sérum du sang coagulé par centrifugation à 4 oC environ. Conservez le sérum en petites quantités à une température inférieure à - 70 oC. Le sérum peut également être cryodesséché. Immédiatement avant de commencer l'hémolyse à l'aide du complément, diluez à 125-200 CH50 par millilitre avec la solution tampon albumine-barbital et maintenez la solution diluée dans un bain de glace pendant l'essai.

Antigène rubéoleux. Antigène approprié pour les titrages de l'inhibition d'hémagglutination. Titre > 256 unités HA.

Traitement des érythrocytes à l'acide tannique. Séparez les érythrocytes par centrifugation d'un volume approprié de sang humain stabilisé. Lavez les érythrocytes 3 fois au moins avec la solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2 puis mettez-les en suspension à 2 p. 100 V/V dans la solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2. Prélevez 0,1 ml de solution d'acide tannique et complétez à 7,5 ml avec la solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2 (concentration finale 1,3 x 10-4 p. 100 m/V); mélangez un volume de la dilution récemment préparée et un volume de la suspension d'érythrocytes et faites incuber à 37o C pendant dix minutes. Recueillez les cellules traitées à l'acide tannique par centrifugation (400-800 g pendant dix minutes),

rejetez le liquide surnageant et lavez les érythrocytes une fois avec la solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2. Remettez les érythrocytes en suspension à 1 p. 100 V/V dans la solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2.

Addition de l'antigène aux érythrocytes. Prélevez un volume approprié (Vs) d'érythrocytes traités à l'acide tannique, ajoutez 0,2 ml d'antigène rubéoleux par 1,0 ml d'érythrocytes et faites incuber à 37o C pendant trente minutes. Recueillez les cellules par centrifugation (400-800 g pendant dix minutes) et rejetez le surnageant, en laissant un volume de 200 ,l. Ajoutez un volume de solution tampon albumine-barbital égal au liquide surnageant rejeté, remettez les érythrocytes en suspension, recueillez-les comme il est décrit ci-dessus et répétez le lavage. Complétez les 200 ,l obtenus aux trois quarts de Vs; on obtient ainsi le volume initial (Vi). Mélangez 900 ,l de solution tampon albumine-barbital et 100 ,l de Vi, qui est ainsi réduit au volume résiduel Vr, et déterminez l'absorbance initiale à 541 nm (A). Diluez Vr par un facteur égal à A à l'aide de solution tampon albumine-barbital. On obtient ainsi le volume final ajusté Vf = Vr x A d'érythrocytes humains sensibilisés et une valeur pour A de 1,0 0,1 dans le cas d'une dilution au 1/10.

Liaison de l'anticorps sur les érythrocytes traités à l'acide tannique et couverts d'antigène. Préparez les solutions suivantes successivement et en double. Utilisez une cuve semi-micro (par exemple, des cuves à usage unique) ou un tube à essai pour chaque solution.

1. Solutions à examiner. Prélevez des volumes de la préparation à examiner contenant 30 mg et 40 mg d'immunoglobuline respectivement et complétez à 900 ,l avec la solution tampon albumine-barbital.

2. Solutions de référence. Préparez la solution comme il est décrit pour la solution à examiner à partir de l'immunoglobuline humaine PBR.

3. Témoin complément. 900 ,l de solution tampon albumine-barbital. A chaque cuve/tube à essai, ajoutez 100 ,l d'érythrocytes humains sensibilisés et mélangez soigneusement.

Laissez reposer pendant quinze minutes, ajoutez 1 000 ,l de solution tampon albumine-barbital, recueillez les érythrocytes par centrifugation (1 000 g pendant dix minutes) de la cuve/tube à essai et enlevez 1 900 ,l du liquide surnageant. Ajoutez 1 900 ,l de solution tampon albumine-barbital et répétez le lavage en laissant un volume final de 200 ,l. Les échantillons peuvent être conservés à 4 oC pendant 24 heures.

Hémolyse provoquée par le complément. Pour la détermination de l'hémolyse,

ajoutez 600 ,l de solution tampon albumine-barbital chauffée à 37 oC à l'échantillon à examiner, remettez les érythrocytes en suspension avec précaution en les pipettant plusieurs fois (cinq fois au moins) et placez la cuve dans le porte-échantillon d'un spectrophotomètre muni d'un thermostat.

Après deux minutes, ajoutez 200 ,l de complément de cobaye dilué à 125-200 CH50/ml, mélangez soigneusement en pipettant le mélange 2 fois puis commencez immédiatement l'enregistrement de l'absorbance à 541 nm en fonction du temps, en utilisant la solution tampon albumine-barbital comme liquide de compensation. Arrêtez l'enregistrement si la courbe de l'absorbance en fonction du temps a nettement dépassé le point d'inflexion.

Evaluation. Déterminez la pente (S) de la courbe d'hémolyse au point d'inflexion approximatif: délimitez sur la courbe dans la partie à plus forte pente des sections par intervalle de temps approprié (par exemple, t = 1 min.) et calculez S, exprimé en A par minute, entre les points d'intersections adjacents. Trouvez la valeur maximale de la pente (Sexp).

Déterminez l'absorbance de départ (As) par extrapolation de la courbe, qui est presque linéaire et parallèle à l'axe du temps dans les premières minutes de l'enregistrement.

Corrigez Sexp selon l'expression:

S' Sexp

Sexp

S' =

AS

Calculez la moyenne arithmétique des valeurs de S' pour chaque préparation. Calculez l'indice de la fonction Fc (IFc) à partir de l'expression:

I Fc 100 x (S' - S'c)

100 x (S' - S'c)

I Fc =

S's - S'c

S' = moyenne arithmétique de la pente corrigée pour la préparation à examiner.

S's = moyenne arithmétique de la pente corrigée pour la préparation de référence.

S'c = moyenne arithmétique de la pente corrigée pour le témoin complément. Calculez l'indice de la fonction Fc de la préparation à examiner. La valeur n'est pas inférieure à celle indiquée dans le feuillet qui accompagne la préparation de référence.

VII.1.1. REACTIFS

Phosphate disodique anhydre. Na2HPO4 (Mr 142,0).

Phosphate monosodique anhydre. NaH2PO4 (Mr 120,0).