Titrage

Le titrage est effectué, de préférence au moyen d'un analyseur enzymatique automatique, à 37 oC, les volumes, concentrations des substrats et les temps d'incubation étant ajustés pour que la vitesse de réaction soit linéaire au moins juqu'à 35 U.I. par millilitre. Les étalons, les échantillons et le substrat de prékallikréine peuvent être dilués si nécessaire avec la solution tampon B.
Faites incuber les étalons ou les échantillons dilués avec le substrat de prékallikréine pendant 10 minutes: le volume de l'étalon ou de l'échantillon avant dilution ne doit pas excéder 1/10 du volume total du mélange d'incubation, afin d'éviter les erreurs dues aux différences de force ionique et de pH.
Faites incuber le mélange ou une partie du mélange avec un volume égal ou supérieur d'une solution d'un substrat chromogène synthétique reconnu spécifique à la kallikréine (par exemple, l'acétate de N-benzoyl-L-prolyl-L-phénylalanyl-L-arginine 4-nitroanilide R ou le dichlorhydrate de D-prolyl-L-phénylalanyl-l-arginine 4-nitroanilide) et dissous dans la solution tampon B. Enregistrez la variation de l'absorbance par minute (DA/min) pendant 2 minutes à 10 minutes à la longueur d'onde appropriée au substrat employé. Pour chaque mélange d'étalon ou d'échantillon, préparez un blanc en substituant la solution tampon B au substrat de prékallikréine.
DA/min par soustraction de la valeur obtenue pour le blanc correspondant.
Préparez une courbe d'étalonnage à partir des valeurs DA/min obtenues avec l'étalon et les concentrations respectives et déterminez la teneur en PKA de la préparation à examiner.
Solution tampon A Tris(hydroxyméthyl)aminométhane: R 6,055 g;
Chlorure de sodium R: 1,17 g;
Hexadiméthrine (bromure d') R: 50 mg;
Sodium (azide de): 0,100 g;
Dissolvez les réactifs dans de l'eau, ajustez le pH à 8,0 avec de l'acide chlorhydrique 2N et complétez à 1 000 ml avec de l'eau.
Solution tampon B Tris(hydroxyméthyl)aminométhane: R 6,055 g;
Chlorure de sodium R: 8,77 g;
Dissolvez les réactifs dans de l'eau, ajustez le pH à 8,0 avec de l'acide chlorhydrique 2N et complétez à 1 000 ml avec de l'eau.

VII.1.1. REACTIFS

Agarose-DEAE pour chromatographie à échange d'ions. Agarose réticulé portant des groupements diéthylaminoéthyle et présenté sous forme de billes.
N-Benzoyl-L-prolyl-L-phénylalanyl-L-arginine 4-nitroanilide (acétate de).
C35H42N8O8 (Mr 703).
Hexadiméthrine (bromure d'). (C13H30Br2N2)n. Polyméthobromure de 1,5-diméthyl-1,5-diaza-undécaméthylène. Poly(dibromure de 1,1,5,5-tétraméthyl-1,5-azonia-undecaméthylène).
Poudre blanche, amorphe, hygroscopique.
D-Prolyl-L-phénylalanyl-L-arginine 4-nitroanilide (dichlorhydrate de).
C26H36Cl2N8O5 (Mr 612).