Essai

Solubilité. Dans le cas d'une préparation cryodesséchée, ajoutez le volume du liquide indiqué sur l'étiquette. La préparation se dissout complètement en 30 min à 20-25 oC.
Détermination du pH (V.6.3.1). Diluez la préparation à examiner dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V jusqu'à une concentration de 1 p. 100 m/V en protéines. Le pH de la solution est de 4,0 à 7,4.
Osmolalité (V.6.25). L'osmolalité de la préparation à examiner n'est pas inférieure à 240 mosmol/kg.
Protéines totales. Diluez la préparation à examiner dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V pour obtenir une solution contenant 15 mg environ de protéines dans 2 ml. Dans un tube à centrifugation à fond rond, introduisez 2,0 ml de cette solution. Ajoutez 2 ml d'une solution de molybdate de sodium R à 7,5 p. 100 m/V et 2 ml d'un mélange de 1 volume d'acide sulfurique exempt d'azote R et de 30 volumes d'eau. Agitez,
centrifugez pendant 5 minutes, décantez le liquide surnageant et laissez égoutter le tube renversé sur du papier filtre. Effectuez le dosage de l'azote dans le culot après minéralisation par l'acide sulfurique (V.3.5.2). Calculez la teneur en protéines en multipliant la quantité d'azote par 6,25. La teneur en protéines n'est pas inférieure à 3 p. 100 m/V. Elle n'est pas inférieure à 90 p. 100 ni supérieure à 110 p. 100 de la quantité indiquée sur l'étiquette.
Composition en protéines. Opérez par électrophorèse de zone (V.6.21) en utilisant comme support des bandelettes de gel d'acétate de cellulose approprié et comme solution d'électrolyte la solution tampon barbital pH 8,6 R1.
Solution à examiner. Diluez la préparation à examiner dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V jusqu'à une concentration de 3 p. 100 m/V en immunoglobuline.
Solution témoin. Reconstituez l'immunoglobuline humaine pour électrophorèse PBR et diluez-la dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V jusqu'à une concentration de 3 p. 100 m/V en protéines.
Déposez sur une bandelette 4,0 ,l de solution à examiner en bande de 10 mm ou déposez 0,4 ,l par millimètre si une bandelette plus étroite est utilisée. Sur une autre bandelette, déposez dans les mêmes conditions le même volume de solution témoin. Appliquez un champ électrique approprié tel que la bande de l'albumine du sérum humain normal dans un électrophorégramme témoin migre de 30 mm au moins. Traitez les bandelettes avec de la solution de noir amido 10B R pendant 5 minutes, puis avec un mélange de 10 volumes d'acide acétique glacial R et de 90 volumes de méthanol R pendant le temps strictement nécessaire pour obtenir la décoloration du support. Développez la transparence du support avec un mélange de 19 volumes d'acide acétique glacial R et de 81 volumes de méthanol R. Mesurez l'absorbance des bandes à 600 nm à l'aide d'un instrument ayant à cette longueur d'onde une réponse linéaire sur l'intervalle à examiner. Effectuez 3 fois la mesure sur chaque bandelette et calculez la moyenne des lectures sur chaque bandelette. Dans l'électrophorégramme obtenu avec la solution à examiner, 5 p. 100 au plus des protéines ont une mobilité différente de celle de la bande principale. Cette limite ne s'applique pas si l'albumine a été ajoutée à la préparation comme stabilisant ; dans le cas des préparations stabilisées par l'albumine, un essai de composition en protéines est effectué pendant la fabrication avant l'addition du stabilisant. L'essai n'est valable que si, dans l'électrophorégramme obtenu avec la solution témoin, la proportion de protéines contenues dans la bande principale est dans les limites indiquées dans la notice accompagnant la préparation de référence.
Distribution de la taille moléculaire. Examinez par chromatographie liquide (V.6.20.4).
Solution à examiner. Diluez la préparation à examiner dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V jusqu'à une concentration appropriée au système chromatographique utilisé. Une concentration entre 4 g/l et 12 g/l et l'injection de 50 ,g à 600 ,g de protéine conviennent généralement.
Solution témoin. Diluez l'immunoglobuline humaine PBR dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V pour obtenir la même concentration en protéines que dans la solution à examiner.
La chromatographie peut être réalisée en utilisant :
- une colonne d'une longueur de 0,6 m et d'un diamètre intérieur de 7,5 mm, remplie de gel de silice hydrophile pour chromatographie R;
- comme phase mobile, à un débit de 0,5 ml par minute, une solution contenant par litre : 4,873 g de phosphate disodique dihydraté R, 1,741 g de phosphate monosodique monohydraté R, 11,688 g de chlorure de sodium R et 50 mg d'azide de sodium R;
- comme détecteur, un spectrophotomètre réglé à 280 nm.
Dans le chromatogramme obtenu avec la solution témoin, le pic principal correspond à l'IgG monomère et il apparaît un pic correspondant au dimère à un temps de rétention relatif au monomère de 0,85 environ. Identifiez les pics dans le chromatogramme obtenu avec la solution à examiner par comparaison au chromatogramme obtenu avec la solution témoin ; les pics ayant un temps de rétention plus petit que celui du dimère correspondent aux polymères et aux agrégats. La préparation à examiner satisfait à l'essai si dans le chromatogramme obtenu avec la solution à examiner:
- le temps de rétention par rapport au pic correspondant dans le chromatogramme obtenu avec la solution témoin est de 1 0,02 pour le monomère et pour le dimère;
- la somme du monomère et du dimère représente 90 p. 100 au minimum de la surface totale du chromatogramme et les polymères et agrégats représentent 3 p. 100 au maximum de la surface totale. Cette exigence ne s'applique pas aux préparations auxquelles de l'albumine a été ajoutée en tant que stabilisant ; dans le cas des préparations stabilisées par l'albumine, un essai de distribution de taille moléculaire est effectué pendant la fabrication avant l'addition du stabilisant.
Activité anticomplémentaire (V.2.1.13). La proportion du complément consommée n'est pas supérieure à 50 p. 100 (1 CH50 par milligramme d'immunoglobuline).
Activateur de prékallikréine (V.2.1.11). Au maximum 35 U.I. par millilitre, calculé par rapport à une dilution de la préparation à examiner contenant 3 p. 100 m/V d'immunoglobuline.
Hémagglutinines anti-A et anti-B (VIII.5). Effectuez les essais des hémagglutinines anti-A et anti-B. Si la préparation à examiner a une teneur en immunoglobulines supérieure à 3,0 p. 100 m/V, diluez-la jusqu'à cette dernière concentration avant de préparer les dilutions à utiliser dans l'essai. Les dilutions au 1/64 ne présentent pas de signes d'agglutination.
Teneur en eau (V.3.5.6). Déterminée par semi-microdosage sur 0,500 g au moins de la préparation à examiner, la teneur en eau d'une préparation cryodesséchée n'est pas supérieure à 3,0 p. 100.
Stérilité (V.2.1.1). La préparation à examiner satisfait à l'essai de stérilité.
Pyrogènes (V.2.1.4). La préparation à examiner satisfait à l'essai des pyrogènes. Injectez à chaque lapin, par kilogramme de masse corporelle, un volume correspondant à 0,5 g d'immunoglobuline, jusqu'à un maximum de 10 ml par kilogramme.
Anticorps contre l'antigène de surface de l'hépatite B. Le taux d'anticorps contre l'antigène de surface de l'hépatite B de la préparation à examiner,
déterminé par une méthode immunochimique appropriée (V.2.1.10) n'est pas inférieur à 0,5 U.I. par gramme d'immunoglobuline.