La directrice générale de l'Agence de la biomédecine,
Vu la loi n° 2013-715 du 6 août 2013 tendant à modifier la loi n° 2011-814 du 7 juillet 2011 relative à la bioéthique en autorisant sous certaines conditions la recherche sur l'embryon et les cellules souches embryonnaires ;
Vu le code de la santé publique, et notamment les articles L. 2151-5, R. 2141-17 à R. 2141-23, et R. 2151-1 à R. 2151-12 ;
Vu la décision du 8 septembre 2015 modifiant la décision 2013-11 du 17 septembre 2013 fixant le modèle de dossier de demande des autorisations mentionnées à l'article R. 2151-6 du code de la santé publique ;
Vu la demande présentée le 30 septembre 2020 par l'Institut national de la santé et de la recherche médicale (CECS I-Stem Inserm UMR 861, Equipe Maladies musculaires, Evry) aux fins d'obtenir le renouvellement de son autorisation de protocole de recherche sur les cellules souches embryonnaires humaines ;
Vu les informations complémentaires apportées par le demandeur ;
Vu le rapport de la mission d'inspection de l'Agence de la biomédecine en date du 11 décembre 2020 ;
Vu les rapports d'expertise en date du 17 décembre 2020 et 25 février 2021 ;
Vu l'avis émis par le conseil d'orientation de l'Agence de la biomédecine le 25 mars 2021 ;
Le projet a pour objectif l'étude de la myopathie de Duchenne (DMD), maladie génétique provoquant une dégénérescence progressive de l'ensemble des muscles de l'organisme. Cette pathologie est liée à une anomalie du gène DMD, porté par le chromosome X, qui code pour la protéine dystrophine, essentielle au maintien de l'intégrité de la fibre musculaire. En l'absence de dystrophine fonctionnelle, les fibres qui constituent les muscles squelettiques, les muscles lisses et le muscle cardiaque s'abiment à chaque contraction et finissent par se détruire.
Le programme de recherche mis en œuvre par l'équipe de Christian Pinset et Cécile Martinat, vise à modéliser la DMD à partir de cellules pluripotentes humaines (iPS) et cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). L'objectif est de mieux caractériser la physiopathologie et comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu.
Le projet de recherche utilise les lignées de cellules souches embryonnaires humaines SA-001 et SA-002.5, provenant de Cellartis AB (Suède), et WA-09, provenant du WiCell Research Institute (Etats-Unis). Elles sont déjà présentes sur le territoire national. Elles ont été importées par Marc Peschanski (Inserm) le 16 février 2005 par arrêté des ministres chargés de la santé et de la recherche dans le cadre du dispositif transitoire mis en place par la loi du 6 août 2004 (article 37), le 27 octobre 2018 par décision de la directrice générale de l'Agence de la biomédecine, et par Anne-Lise Bennaceur (Inserm) dans le cadre d'un protocole de recherche sur les cellules souches embryonnaires autorisé par la directrice générale de l'Agence de la biomédecine le 20 septembre 2006 en application des dispositions de l'article L. 2151-6 du code de la santé publique.
A l'occasion de l'examen des demandes d'autorisation d'importation de ces lignées de cellules souches embryonnaires humaines, le respect des exigences posées par les articles 16 à 16-8 du code civil et de celles relatives à l'information et au recueil du consentement des couples a été vérifié et la demande de renouvellement d'autorisation de recherche présente de nouveau l'ensemble des documents permettant de s'assurer du respect des dispositions législatives et réglementaires relatives à l'importation de telles cellules. Le conseil d'orientation souligne d'ailleurs dans son avis que l'ensemble de ces documents sont de nouveau fournis en annexe.
Une première autorisation a été accordée à cette équipe en 2010 pour une durée de cinq ans et a été renouvelée par décision de la directrice générale de l'Agence de la biomédecine en 2015.
Depuis la première autorisation, cette équipe a mis au point et validé les protocoles de différenciation permettant de reproduire les étapes-clés allant de la cellule pluripotente à la fibre musculaire. Elle a ainsi identifié une isoforme embryonnaire de la dystrophine spécifique de l'homme, qui est induite par le facteur de croissance BMP4 dans les CSEh et les iPS. L'existence de cette isoforme embryonnaire a conduit l'équipe à envisager la DMD comme une pathologie présente dès les premiers stades du développement malgré le caractère plus tardif de son expression clinique, au moment de l'acquisition de la marche.
L'équipe a également étudié les conséquences d'une absence d'expression de dystrophine au sein des cellules souches sur leur différenciation en cellules musculaires. Pour ce faire, elle a créé une lignée de CSEh SA001 génétiquement modifiée à l'aide de l'outil CRISPR/Cas9 (délétion des exons 7 et 52) et a mené des expériences de comparaison avec la lignée non modifiée. Les analyses multimomiques (RNAseq, miRNAseq, scRNAseq, proteomic) ont montré que les cellules dérivées des CSEh porteuses de la mutation DMD reproduisent les altérations moléculaires observées chez les patients. Un déficit d'expression des ARNs codant pour des protéines mitochondriales, pour des protéines des jonctions cellulaires ainsi qu'une diminution des transcrits du locus H19/IGF2 ont été notamment observés lors de la formation des somites (structures transitoires cruciales pour l'initiation des compartiments musculaires) au cours du protocole de différenciation. Ces données apportent un nouvel éclairage sur le rôle potentiel de la dystrophine dans la pathologie et la différenciation myogénique, en dehors de son rôle sur l'intégrité de la fibre musculaire adulte.
La présente demande s'inscrit dans la continuité du protocole précédent. L'objectif général de la demande de renouvellement est de caractériser les mécanismes physiopathologiques à l'origine de la DMD et à développer une stratégie thérapeutique selon trois axes conduits en parallèle :
- la compréhension des conséquences liées à l'absence de dystrophine au cours de la différenciation des cellules souches en cellules musculaires, en particulier lors de la formation des somites. Une attention particulière sera portée sur les familles de protéines impliquées dans les jonctions cellulaires comme les cadhérines et les claudines, connues pour leur implication dans la formation et le maintien de structures nécessaires à l'entrée des cellules dans les compartiments musculaires ;
- l'étude des modifications fonctionnelles associées à une perte de fonction de la dystrophine lors des différentes étapes du développement myogénique, plus particulièrement pour ce qui concerne la régulation calcique et les fonctions mitochondriales. Ces approches seront menées en collaboration avec des équipes françaises (Stéphane Sébille, Université de Poitiers) et européennes (Krzysztof Zablocki, Université de Varsovie) ;
- la mise au point de stratégies d'édition génomique ciblant la dystrophine en vue de développer de nouveaux modèles ex vivo de la maladie. Cette partie sera menée en collaboration avec l'équipe de Matteo Bovolenta à l'AFM. Ces modèles seront notamment utilisés en vue d'évaluer les approches de saut d'exon par oligonucléotides anti-sens, qui permettent de restaurer le cadre de lecture du gène DMD muté et ainsi rétablir l'expression de protéines potentiellement fonctionnelles. L'objectif est d'identifier de petites molécules augmentant l'efficacité du saut d'exon par une approche de criblage à haut débit.
Le conseil d'orientation souligne dans son avis l'originalité et la valeur ajoutée de la demande qui sont sous-tendues par la possibilité technique d'agir directement sur le gène de la dystrophine pour proposer de telles stratégies.
La finalité médicale du projet et l'objectif thérapeutique sont clairement exprimés par l'équipe. La DMD est une maladie particulièrement grave, la plus fréquente des myopathies d'origine génétique (1/3500 naissances) et incurable en l'état actuel des connaissances. Il s'agit de trouver de nouvelles voies thérapeutiques pour traiter les patients atteints de DMD grâce à une meilleure connaissance de l'impact de l'absence de dystrophine à différentes étapes de la différentiation cellulaire vers la voie musculaire squelettique mais aussi par la recherche de molécules pouvant agir sur l'épissage du gène de la dystrophine permettant de restaurer l'expression d'une protéine fonctionnelle. Cette demande de renouvellement poursuit les aspects explorés dans le protocole autorisé initialement.
Le résultat escompté ne peut être obtenu par d'autres moyens, notamment par le recours exclusif à d'autres types de cellules souches. S'agissant des cellules souches embryonnaires murines et primates, il n'est pas envisageable d'utiliser des cellules d'origine animale alors que l'objectif général du projet est de développer un produit de thérapie cellulaire en vue d'une utilisation en clinique chez l'Homme.
Si la dystrophine embryonnaire a été dans un premier temps découverte dans les cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS), il apparaît essentiel que ce résultat soit validé avec les cellules souches embryonnaires humaines afin de s'assurer qu'il ne s'agisse pas d'un effet dû à la reprogrammation. L'équipe travaille aussi sur des lignées iPS DMD mais le recours aux CSEH est indispensable car il a permis, entre autre, d'invalider le gène DMD par CRISPR/Cas 9, étape essentielle dans la conduite de la recherche.
Le projet a pour objectif le traitement des pathologies musculaires squelettiques (muscles se trouvant sous le contrôle du système nerveux central). Un prérequis pour la mise au point de ces thérapeutiques est de disposer d'un modèle robuste, fiable et utilisant des cellules humaines. Seules de très rares équipes dans le monde ont réussi de façon convaincante à différencier des CSEh en précurseurs musculaires squelettiques maturant en fibres musculaires fonctionnelles, dont l'équipe de Christian Pinset fait partie.
L'utilisation exclusive des cellules iPS pour analyser le rôle de la dystrophine pourrait en outre aboutir à des conclusions erronées. Cette protéine est en effet considérée comme un suppresseur de tumeur ; son absence (ou sa mutation), combinée aux altérations inhérentes à la reprogrammation, pourraient s'avérer délétères. Il est également admis que les cellules iPS ne possèdent pas la même efficacité que les CSEh quant à l'induction de leur différenciation dans de nombreux lignages.
Compte tenu des difficultés d'établissement de protocoles de différenciation musculaire de cellules pluripotentes, le conseil d'orientation considère enfin qu'il est essentiel de tester ces protocoles avec des lignées de CSEh partagées par les différentes équipes de recherche internationales travaillant sur ce type de projet.
Le demandeur apporte les éléments suffisants concernant la pertinence scientifique du projet de recherche d'une part, et ses conditions de mise en œuvre au regard des principes éthiques d'autre part. Il justifie en particulier que le projet sera mené dans le respect des principes éthiques relatifs à la recherche sur l'embryon et les cellules souches embryonnaires humaines et que ces cellules ont été obtenues conformément aux dispositions législatives et réglementaires applicables.
Les titres, diplômes, expérience et travaux scientifiques fournis à l'appui de la demande permettent de s'assurer des compétences du responsable de la recherche et des membres de l'équipe en la matière. La demande est présentée par Cécile Martinat, directrice de recherche Inserm, qui dirige une des quatre équipes du laboratoire iStem (créé par Marc Peschanski), et Christian Pinset, directeur de recherche CNRS émérite. L'équipe dédiée au projet comprend 5 personnes, dont un ingénieur de recherche et un chercheur titulaires impliqués au moins à 50%. Le projet a initialement démarré en 2010, l'équipe dispose donc d'une grande expérience des techniques utilisées dans ce programme. Le nombre important de publications issues de ce projet montre l'excellent niveau de cette équipe.
La pérennité de l'unité ne fait aucun doute, et le financement de ce projet (estimé à 54.000 euros par an) est assuré par les fonds propres du laboratoire iStem, ainsi que divers financements déjà acquis, notamment auprès du Génopole et de la fondation pour la recherche médicale.
Enfin, les locaux, matériels, équipements, procédés et techniques sont adaptés à l'activité de recherche envisagée. Cette recherche sera effectuée dans des conditions permettant de garantir la sécurité des personnes exerçant une activité professionnelle sur le site, le respect des dispositions applicables en matière de protection de l'environnement, le respect des règles de sécurité sanitaire ainsi que la sécurité, la qualité et la traçabilité des cellules embryonnaires. Les conditions matérielles de sécurité, de conservation, d'accès, de transferts, de locaux dédiés, de sécurisation desdits locaux, de désinfection, la qualité de l'ensemble des plateaux techniques sont parfaitement décrites et n'ont fait l'objet d'aucune réserve de la part de la mission d'inspection de l'Agence de la biomédecine dans son rapport et à l'occasion de sa visite sur place le 10 décembre 2020. Le laboratoire dispose des équipements nécessaires à la mise en œuvre de ce protocole de recherche dans des conditions optimales,
Décide :
